Молекулярно-генетическая идентификация аллелей S2 и S10 гена самонесовместимости у кребов и элитных селекционных форм яблони

На современном этапе развития методов генетики широкое применение нашли методы ДНК-маркирования, которые основаны на анализе полиморфизма генома. ДНК-маркеры широко используются при изучении генофонда культурных растений: для оценки генетических взаимосвязей изучаемых образцов в коллекциях генетических ресурсов; для ДНК-паспортизации сортов; картирования генов и их отслеживания в селекционном процессе (маркер-опосредованная селекция, позволяющая проводить идентификацию и отбор генотипов, несущих целевые гены, без их оценки по фенотипу) [1]. Необходимо отметить, что ДНК-маркерный отбор может быть наиболее востребованным при оценке признаков, для которых фенотипическая оценка является сложной процедурой или требует временных затрат и зависит от условий окружающей среды.

Для яблони - основной плодовой культуры, высокой актуальностью обладает вопрос, связанный с подбором опылителей и, соответственно, связанным с этим определением совместимости сортов при опылении. От этого напрямую зависит продуктивность садового агроценоза. В системе самонесовместимости яблони основная функция в регуляции принадлежит гену самонесовместимости (S-ген). Продукты S-гена в пестике - цитотоксические протеины с рибонуклеазной активностью (S-РНКазы). В процессе самонесовместимого взаимодействия S-РНКазы контролирует прорастание пыльцевой трубки, проникая в цитоплазму и деградируя пыльцевую РНК [2]. Пыльцевые трубки, прорастающие из пыльцы с определенной аллелью S-гена, ингибируются в пестиках растений, несущих тот же аллель [3]. Следовательно, оплодотворение блокируется, когда S-аллель пыльцы совпадает с одной или двумя S-аллелями пестика. Два сорта, несущие идентичный набор аллелей S-гена являются несовместимыми. При взаимоопылении таких сортов оплодотворения и последующего формирования плодов не происходит. Сорта, частично совместимые, несут по одной одинаковой S-аллели. Они могут являться опылителями друг для друга, однако эффективность опыления при этом снизится на уровень около 50% [2]. Необходимо сказать, что данный уровень снижения будет обусловлен исключительно генотипом сорта, при воздействии дополнительных факторов (расхождения в сроках цветения, низкая жизнеспособность пыльцы сорта-опылителя, неблагоприятные погодные условия) уровень закладки плодов снизится еще значительнее. Очевидно, что для максимальной реализации потенциала продуктивности сортов яблони необходимо выполнять формирование сортовых схем садового насаждения с учетом совместимости при опылении - использовать наиболее эффективных опылителей или комбинации сортов с наибольшим уровнем совместимости. В этой связи, важным этапом является определение аллельного набора S-гена у сортов.

Одним из перспективных путей получения максимального уровня опыления в садовом агроценозе является использование так называемых кребов яблони - сортов и форм, представляющих, как правило, образцы видов рода Malus или их межвидовые гибриды с яблоней домашней (Malus domestica Borch). Ряд кребов уже зарекомендовали себя в качестве перспективных опылителей для создания моносортных насаждений промышленных сортов, однако, учитывая разнообразие данных сортов и форм и постоянное пополнения промышленного сортимента яблони новыми сортами, следует отметить важность знаний об аллельном составе S-гена у кребов. Это позволит рекомендовать наиболее перспективные среди них для сортов яблони.

Очевидно, что применение ДНК-маркеров для экспресс идентификации аллельных комбинаций данного гена обладает значительным преимуществом в сравнении с фенотипической оценкой совместимости, так как может быть выполнено в сжатые сроки. На настоящее время молекулярно-генетический контроль данного процесса глубоко изучен, известно порядка 25 аллелей S-гена. Однако в культурном мировом генофонде яблони наиболее распространены 7-8 основных аллелей, из которых аллели S2, S3, S5, S7, S10 являются наиболее распространенными [4, 5].

Использование ДНК-маркеров определило возможность идентификации аллелей гена самонесовместимости среди образцов коллекций генетических ресурсов яблони в различных странах, где возделывается данная культура [6]. В отечественных генетических исследованиях яблони также получены результаты об аллельных комбинация искомого гена у сортов российской селекции, а также перспективных селекционных форм (элитных форм) [7 - 10].

Важность этих исследований очевидна - появляется возможность прогнозировать степень совместимости сортов при опылении, что позволяет эффективно комбинировать сорта в садовом насаждении, размещая максимально совместимые сорта в саду в непосредственной близости. Это позволит получать наибольший уровень завязи плодов и, соответственно, урожайности, а также создавать моносортные насаждения, экономя затраты на проведение защитных мероприятий и уборку плодов. Наряду с этим, данные об аллельном составе гена самонесовместимости могут являться частью ДНК-паспортов сортов яблони в комплексе с микросателлитным ДНК-фингерпринтом.

В связи с вышесказанным, в задачи наших исследований входило выполнение ДНК - маркерной идентификации аллельных комбинаций гена самонесовместимости у сортов и форм кребов. На данном этапе работы целевыми являлись аллели S2 и S10, относящиеся к числу наиболее распространенных аллелей в мировом сортименте яблони.

Материал и методы исследований

Объектами исследования послужили кребы и элитные селекционные формы яблони. ДНК экстрагировали методом ЦТАБ [11]. Для идентификации аллелей гена самонесовместимости использовали метод полимеразной цепной реакции ПЦР, согласно общепринятым рекомендациям [12] с праймерами, фланкирующими маркерные участки аллелей S2 и S10 гена самонесовместимости [4]. Использовали следующие концентрации компонентов реакционной среды: В состав ПЦР смеси входили: 40-50 нг ДНК, 0,05мМ dNTPs, 0,3мкM каждого праймера, 1 единица активности (е.а.) Taq-ДНК полимеразы, в общем объеме реакционной смеси 25мкл. Постановку ПЦР осуществляли по следующей программе: 5 минут при 94о С - начальная денатурация; следующие 35 циклов: 30 секунд денатурация при 94о С, 40 секунд отжиг праймеров при 60о С, 30 секунд элонгация при 72о С; последний цикл элонгации 5 минут при 72о С.

Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 2% агарозном геле, на основе трис боратного буфера при напряжении 150 V в течение 30 минут. Гелевые пластины окрашивали бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолете.

Результаты

Получены результаты молекулярно-генетической идентификации целевых аллелей гена самонесовместимости для 27 кребов и 2 элитных селекционных форм яблони. В изученной выборке образцов идентифицировали обе целевые аллели. На рисунках 1 и 2 представлены результаты ПЦР идентификации данных аллелей у изучаемых образцов.

Рисунок 1 - Идентификация аллели S2 у образцов яблони

Примечания: М-маркер молекулярной массы ДНК; К+ - сорт контроль Гала; 1-8- исследуемые образцы яблони: 1- Спартак,

• 2 - Китайка № 3, 3 - 2-66-10, 4 - Транс Люценс, 5 - Империал Павла,
• 6 - Пиотош, 7 - Эксцельзиор, 8 - Желтогибридное

Рисунок 2 - Идентификация аллели S10 у образцов яблони

Примечания: М-маркер молекулярной массы ДНК; К+ - сорт контроль Мекинтош; 1-8 - исследуемые образцы яблони: 1- Желтое румяное, 2- Темно-вишневое, 3- Креб 2-71, 4- 12/1-20-34, 5- 12/2-20(24-28), 6- Геспер Роз, 7- Фейри

Выявление фрагмента на электрофореграмме на уровне, отмеченном стрелкой, соответствующем стандартному образцу, свидетельствует о наличии искомого аллеля гена самонесовместимости, отсутствие фрагмента - об отсутствии аллеля. В ходе исследования идентифицировали все целевые аллели, однако, с разной частотой встречаемости. Наиболее редким оказался аллель S10, который был выявлен у одного образца - элитной формы 12/1-20-34. Результаты генотипирования изученной выборки генотипов яблони по локусу S-гена представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Идентификация аллелей S-гена у образцов яблони

Как видно из таблицы аллели идентифицируются со значительной разницей в частоте встречаемости. Если аллель S2 идентифицировался у 14 образцов (13 кребов и 1 элитной селекционной формы), то аллель S10 - лишь у одного образца (элитной формы 12/2-20(24-28). Примечательно, что аллель S10, относится к наиболее распространенным в мировом генофонде яблони, однако в изученной выборке образцов яблони он не распространен. Видно, что у кребов не идентифицируются одновременно два аллеля из представленных. В случае одновременного наличия у них двух изученных аллелей, которые являются наиболее распространенными, существенно возросла бы вероятность совпадения аллельного набора у креба и того промышленного сорта, для которого он предлагается как опылитель. На данном этапе работы, можно сделать заключение о том, что кребы Пестрокрасное, Красно-вишневое, Краснополосатое, Китайка малиновая, Рислинг красный, Виктория, Кетни, Джон Дауни, Империал Павла, Фейри, Желтозеленое, Никита, Гертруда и Экселенц Тиль можно рекомендовать, как более перспективные опылители из изученной выборки, так как у них не были выявлены аллели S2 и S10, которые относятся к числу наиболее распространенных в мировом генофонде яблони. Однако, необходимо сказать также и о целесообразности дальнейшего проведения молекулярно-генетической идентификации таких распространенных аллелей как S3, S5, S7, S1. Это даст возможность более обоснованно дать рекомендации по использованию изученных кребов в качестве опылителей для сортов, наиболее распространенных в промышленном садоводстве.

Литература

• 1 Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве / Э.Е. Хавкин // Сельскохозяйственная биология. - 1997.- № 5.- С.3-19.
• 2 Суриков И. М. Несовместимость и эмбриональная стерильность растений. М.
• 1991. - 220 с.
• 3 Broothaerts W. cDNA cloning and molecular analysis of two self-incompatibility alleles from apple / W. Broothaerts, G. Janssens, P. Proost et al. // Plant Mol Biol. - V. 27. - 1995. -- P. 449-511.
• 4 Janssens G. A. A molecular method for S-allele identification in apple based on allele-specific PCR / G.A. Janssens, I.J. Goderis, W.F. Broekaert et al. // Theor. Appl. Genet. - 1995. - V. 91. - P. 691-698.
• 5 Broothaerts W. New findings in apple S-genotype analysis resolve previous confusion and request the re-numbering of some S-alleles // Theor Appl Genet. - V.106. _ 2003. - P. 703-714
• 6 Hegedыs A. Review of the self-incompatibility in apple (MalusЧdomestica Borkh., syn.: Malus pumila Mill.) // International Journal of Horticultural Science. V. 12. - 2006. - P. 31-36.
• 7 Супрун И. И. Молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости у сортов яблони отечественной селекции / И. И. Супрун, Е. В. Ульяновская, Я. В. Ушакова, Е. Т. Ильницкая // Доклады РАСХН. - 2011. - №5. - С. 15-17.
• 8 Супрун И. И. Использование методов ДНК-маркирования для идентификации аллелей гена самонесовместимости яблони // И. И. Супрун, Е. В. Ульяновская, Я. В. Ушакова / Труды Кубанского государственного университета. - №1(22), 2010. - с. 57-59.
• 9 Супрун И. И. Цитолого-генетическое изучение особенностей опыления иммунных и высокоустойчивых к парше сортов яблони // И. И. Супрун, Е. В. Ульяновская, Я. В. Ушакова / Агро ХХI. - №1-3, 2010. - с. 27-28.
• 10 Супрун И.И., Ульяновская Е.В. Изучение аллельного полиморфизма гена самонесовместимости и цитологических особенностей опыления сортов яблони // Плодоводство и виноградарство Юга России [Электронный ресурс] 2012. № 13 (01). URL: http://journal.kubansad.ru/pdf/12/01/02.pdf.
• 11 Murray, M. G. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA / M. G. Murray, W. F. Thompson // Nucleic Acids Research, 1980.-V. 10.- Р. 4321-4325.
• 12 Шибата, Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов // Молекулярная клиническая диагностика. - М.: Мир, 1999. - С. 395-427.